La fosfatidilserina 148

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La interacción entre la fosfatidilserina y la respuesta inmune del receptor de fosfatidilserina inhibe in vivo 1 Resumen La fosfatidilserina (PS) en las células apoptóticas promueve su absorción e induce respuestas antiinflamatorias en los fagocitos, incluyendo la liberación de TGF. Poco se sabe sobre los efectos de PS en la respuesta inmune adaptativa. Por ello, investigó los efectos de PS que contienen liposomas sobre la respuesta inmune en ratones in vivo. PS liposomas específicamente respuestas inhibidas a Ags según lo determinado por la disminución de drenaje masa de tejido de los ganglios linfáticos, con un número reducido de leucocitos totales y las células T CD4 Ag-específicas. También hubo una disminución en la formación y el tamaño de los centros germinales en el bazo y los ganglios linfáticos, acompañado de niveles disminuidos de Ag-IgG específica en la sangre. Muchos de estos efectos fueron imitados por un agonista Ab-específico para el receptor PS. TGF parece jugar un papel crítico en esta inhibición, ya que los efectos inhibidores de la PS se invirtieron mediante la administración in vivo de anti-TGF-Ab. PS-liposomas que contienen no parecen inhibir directamente la maduración de células dendríticas in vitro en respuesta a una variedad de estímulos, ni tampoco evitar su migración a los ganglios linfáticos regionales en vivo, lo que sugiere que los efectos inhibidores pueden ser el resultado de interacciones complejas entre las células del tejido y las células dendríticas, posteriormente inhiben su capacidad para activar los linfocitos T de forma productiva. Introducción La rápida inmersión de las células apoptóticas por los fagocitos profesionales y no profesionales impide la liberación del contenido intracelular potencialmente tóxicos o inmunogénicas de las células que mueren (1. 2. 3. 4). Mucha atención se ha centrado recientemente en los efectos de las células apoptóticas en los fagocitos absorbiéndolos. Las interacciones entre los macrófagos y las células apoptóticas como resultado la secreción de mediadores antiinflamatorios tales como TGF, IL-10, y PGE 2. así como la inhibición de la producción de mediadores proinflamatorios (5. 6. 7. 8. 9. 10. 11). Resultados similares se han encontrado con los fagocitos nonleukocytic incluyendo fibroblastos y células epiteliales (ref.12 J. Monks y V. A. Fadok, observaciones no publicadas). Además, las células apoptóticas se han demostrado en algunos casos, para inhibir la maduración de células dendríticas y la presentación Ag (13. 14. 15). Las células apoptóticas también han sido demostrado que afectan a la inflamación y la respuesta inmune adaptativa in vivo, aunque los resultados son contradictorios. Por ejemplo, las células apoptóticas se han demostrado ser adyuvantes pobres en comparación con sus homólogos necróticas en la generación de hipersensibilidad de tipo retardado (15). Otra evidencia sugiere que la absorción de las células apoptóticas no es un evento inmunológicamente nula, pero es capaz de modular la respuesta inmune a auto-Ags través de la inducción de tolerancia de células T (16). Los efectos tolerizantes de células apoptóticas se han demostrado aún más en estudios en los que la inyección de células apoptóticas rechazo de aloinjertos de médula ósea (17) inhibió. Por el contrario, se ha sugerido que las células tumorales apoptóticas pueden estimular respuestas antitumorales in vitro y posiblemente in vivo (18. 19. 20. 21). Sorprendentemente, poco se sabe acerca de los mecanismos por los cuales las células apoptóticas inhiben la inflamación y la respuesta inmune adaptativa. La exposición de la fosfatidilserina fosfolípido aniónico (PS) 3 en el prospecto exterior de la membrana plasmática es uno de los cambios más notables y consistentes en la superficie de las células apoptóticas (22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29) . Se ha sabido por algún tiempo que la PS puede inhibir la producción de macrófagos de citoquinas proinflamatorias y NO, y que puede bloquear el asesinato de macrófagos de parásitos intracelulares (30. 31. 32. 33. 34. 35. 36). Los datos derivados de los experimentos in vitro e in vivo sugieren que la exposición PS es crucial para la liberación de TGF por los fagocitos que acompaña reconocimiento de apoptosis celular y la absorción de (11. 37. 38). Además, PS-que contiene liposomas puede imitar la respuesta a las células apoptóticas mediante la generación de la liberación de TGF-(11. 38). El bloqueo de PS en células apoptóticas con anexina V (un dependiente de Ca 2, la proteína de unión a PS) se ha demostrado para eliminar los efectos inhibitorios de las células apoptóticas en las respuestas humorales (39). La hipótesis de que PS expuesta sobre las células apoptóticas fue un factor clave en la inhibición de la respuesta inflamatoria necesaria para la supervivencia de los linfocitos T y la posterior activación de la respuesta inmune adaptativa (40. 41) Ag-específica. Si esto es cierto, PS debe inhibir las respuestas inmunes in vivo. Usando tres inmunógenos diferentes y varios ensayos diferentes para medir la respuesta inmune, se determinó que PS respuestas inhibidos de CD4 Ag-específica T y células B in vivo, y que estos efectos podrían ser imitados usando un Ab activación dirigido contra el receptor PS específicamente estéreo . Además, estos efectos inhibidores podrían invertirse, al menos en parte, con anti-TGF-Ab, que implican a TGF como un importante mediador de la respuesta inhibitoria a PS. liposomas que contienen PS-no parecen bloquear la maduración de las células dendríticas derivadas de la médula ósea en respuesta a endotoxina bacteriana, TNF, u otros estímulos como se determina por la alternancia en la expresión de marcadores de superficie o por la capacidad para presentar Ag a los linfocitos CD4. liposomas que contienen PS-También en falso la migración inducida por Ag de las células dendríticas en los ganglios linfáticos regionales en vivo. Tomados en conjunto, estos hallazgos sugieren que PS inhibe la respuesta inmune mediante la inhibición de la inflamación en el tejido. Materiales y Métodos Los ratones Balb / Cann y ratones C57BL / 6 machos fueron adquiridos de cualquiera de The Jackson Laboratory o Harlan Criadores y se alojaron en el Centro de Recursos Biológicos, Médico Nacional Judía y el Centro de Investigación (Denver, CO). Los ratones se usaron a la edad de 68 semanas. DO11.10 de células T CD4 ratones transgénicos en el fondo BALB / c fueron criados en el Centro de Recursos Biológicos. Abs abs y los reactivos incluidos aloficocianina-conjugado y conjugado con PE anti-CD4 (IgG2b de rata, clon GK1.5 eBioscience), y CyChrome anti-CD16 / CD32 (IgG2b de rata, clon 2.4G2 BD Pharmingen). Se utilizó la hemocianina de lapa ojo de la cerradura anti-(KLH) (IgG3 de ratón, C58-1765 BD Pharmingen) para determinar las curvas de calibración para experimentos de ELISA. KJ1-26 biotinilado fue adquirido de Caltag laboratorios. Alexa 488 estreptavidina conjugada era de Molecular Probes. Conjugado con FITC anti-ratón CD19, conjugado con FITC anti-ratón de CD138 CD11c anti-ratón (syndecan-1), y conjugado con PE se compraron de BD Pharmingen. Alexa 488 F4 conjugado / 80 se adquirió de Caltag laboratorios. monoclonal de ratón anti-TGF-1, -2, -3 y se obtuvo de R eBioscience) y suero preinmune de pollo (Aves Labs). Abs secundaria incluye Cy3-IgG de cabra anti-rata y conejo Cy3-IgY anti-pollo (The Jackson Laboratory). Para el aislamiento de las células CD4 T de bazo y los ganglios linfáticos, Abs utilizados incluyeron uno como se lista anteriormente (anti-MHC de clase II). Además, anti-CD8 (53-6,7), anti-B220 (RA3-6B2) tanto de eBioscience. y F4 / 80 (Caltag Laboratories) se utilizaron para células de la capa para la selección negativa. PS bovina cerebro, hígado bovino fosfatidilcolina (PC), 1-palmitoil-2-oleoil-sn-3-glycerphosphorylcholine (POPC), 1-palmitoil-2-oleoil-sn-3-glycerphospho - l serina (POP - l - S) y el colesterol se obtuvieron de Avanti Polar Lipids. One-palmitoil-2-oleoil-sn-3-glycerphospho - d serina (POP - d - S) se sintetizó a partir POPC por la fosfolipasa D de cambio grupo de cabeza catalizada en presencia de d serina (42. 43). Los liposomas unilamelares se prepararon como se ha descrito previamente (38). Los liposomas que contenían relación molar 80:20 de PC para el colesterol, o (PS cerebro, POP - l - S o POP - d - S) PS en 30:30:40 PC a PC con el colesterol. En algunos casos, los liposomas contenían POP - l - S o POP - d - S en 02:58:40 PS a PC con el colesterol. péptido sintético (2W AWGALANWAVDS, 12-mer) se preparó, se purificó mediante cromatografía de fase inversa, y se analizaron por espectrofotometría de masas en el Centro de Recursos Molecular, Médico Nacional Judía y Centro de Investigación. KLH libre de endotoxina se adquirió de Calbiochem. CFA se adquirió de Sigma-Aldrich. LPS se adquirió de Sigma-Aldrich (Escherichia coli O111: B4) y se resuspendió en solución estéril de NaCl 0,9. OVA se adquirió de Sigma-Aldrich y se resuspendió en PBS. OVA 323339 péptido fue sintetizado por el Centro de Recursos Molecular, Médico Nacional Judía y el Centro de Investigación, utilizando la química florenyl metoxicarbonilo en una sinfonía / Multiplex sintetizador de péptidos. Oligodesoxinucleótidos que contienen motivos CpG (5-TCCATGA CG TTCCTGATGCT-3) o, como control, motivos GPC (5-TCCATGA GC TTCCTGATGCT-3) también se sintetizaron por el Centro de Recursos Molecular. Vacunas Para algunos experimentos, se inyectó a los ratones BALB / Cann s. c. en el flanco trasero derecho usando una aguja de calibre 25. Los ratones fueron inyectados primero con 100 l de PBS, liposomas de PC (0,5 mg de lípido total), o liposomas PS (0,5 mg de lípido total). PC y PS-que contienen liposomas consistieron en 60:40 relación molar PC al colesterol y 30:30:40 relación molar PS a PC con el colesterol, respectivamente. Alternativamente, los ratones fueron inyectados con liposomas (0,5 mg de lípido total) que contiene PC, ya sea POP - l - S o POP - d - S, y colesterol (relación molar 30:30:40). Después de 1 h, los ratones fueron inyectados con 150 l de emulsión que contiene 50 g de OVA o 150 g de KLH en CFA en la misma región. los ratones de control negativo no fueron inmunizados. Para otros experimentos, los ratones C57 / BL6 fueron inyectados con PBS, los liposomas de PC, o liposomas PS como se describe anteriormente. Después de 1 h, los ratones fueron inyectados con 150 l de emulsión que contiene 50 g de péptido 2W y CFA en la misma región. los ratones de control negativos se mantuvieron en jaulas adyacentes y no se inmunizaron. Determinación de la masa de tejido Siete días después de la inmunización, los ratones fueron sacrificados y los bazos y los ganglios linfáticos retira cuidadosamente y se diseca libre de grasa circundante. Se determinó la masa de tejido utilizando una balanza electrónica Fisher Scientific A-160. Los ganglios linfáticos inguinales superficiales incluyen 2, 2 axilar y 2 ganglios axilares laterales (6 nodos / ratón). Determinación de centro germinal desarrollo (GC) en el bazo y los ganglios linfáticos Catorce días después de la inmunización, los ratones fueron sacrificados y los bazos y los ganglios linfáticos inguinales superficiales eliminado. Los tejidos fueron embebidos en compuesto de temperatura óptima de corte usando Tissue-Tek criomoldes (VWR), flash-congelado en 2-metilbutano enfriado con hielo seco, y se almacenaron a 70ºC. Secciones (7 m) se cortaron en un criostato (Equipment International), se montaron en portaobjetos de vidrio (Fisher Scientific), y se fijaron en acetona durante 5 min a temperatura ambiente. Las secciones se bloquearon durante la tinción inespecífica con PBS que contenía 5 FCS durante 10 min a temperatura ambiente. Las secciones fueron incubadas con aglutinina de cacahuete con biotina (PNA Vector Laboratories) a una concentración final de 5 g / ml durante 30 min a temperatura ambiente. a continuación, las secciones se lavaron con PBS y biotina-PNA se detectó usando el kit Vectastain ABC y el kit de sustrato DAB (Vector Laboratories) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las secciones fueron contrastadas mediante una tinción HE comunes. Número y tamaño de los GC se determinaron para cada sección del bazo usando un software de IP Labs microscopio de contraste de fase y. Para cada ratón, al menos dos secciones fueron escogidos al azar que eran de áreas del bazo al menos 100-m. Ag estimulación de las células del bazo y de los ganglios linfáticos Diez días después de la inmunización KLH, los ratones fueron sacrificados y los bazos y los ganglios linfáticos. Los tejidos se recogieron y se aislaron las células como se describió anteriormente. Las células de bazo y de ganglios linfáticos se sembraron por triplicado en 200 l de medio completo (RPMI 1640 que contiene 10 FCS (Atlanta Biologicals), 1 penicilina / estreptomicina / l - glutamine, piruvato de sodio 1 mM, bicarbonato de sodio 0,2, 0,1 mM esenciales y no esenciales aminoácidos, 14,4 M 2-ME, y 2,92 mg / ml l - glutamine por pocillo en placas de 96 pocillos a una concentración de 1 10 6 5 y 10 5 células por pocillo, respectivamente. se añadió KLH a cada pocillo a una final concentración de 100 g / ml. Las células se incubaron a continuación a 37ºC y 5 CO 2 durante 3 días. Determinación de suero nivel inmunización IgG de ratones macho BALB / Cann con liposomas y KLH / CFA se llevaron a cabo como se describe anteriormente. Nueve días después de la inmunización, los ratones fueron sacrificados y la sangre total extraída por punción cardiaca. La sangre se dejó coagular a temperatura ambiente durante 1 h, se centrifuga a 14.000 rpm durante 15 min, y se eliminan del suero. El suero se diluyó con tampón de ELISA (PBS con 3 BSA y 0,02 azida de sodio) de 1/200 a 1/3200. El noventa y seis pocillos se recubrieron placas de ELISA (BD Falcon) como se ha descrito previamente (44) con la proteína KLH en tampón de ELISA (1 g / pocillo). Las diluciones de suero se añadieron a las placas (50 l / pocillo) y se dejó incubar durante 2 h a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron con PBS cinco veces y luego peroxidasa se añadió IgG anti-ratón (Jackson ImmunoResearch) a una dilución final de 1/100 y se incubó a temperatura ambiente durante 2 h. Después de cinco lavados con PBS, se detectó la cantidad de Ab secundario unido a la placa con solución de sustrato de peroxidasa (KPL). El desarrollo de color se evaluó utilizando un lector automático de microplacas (EL309) por Bio-Tek Instruments. Los datos fueron analizados utilizando una opción de ajuste de la curva log / log de software Delta Soft 3 para Macintosh (Biometallics). i. v. transferencia adoptiva de células T DO11.10 transgénico Para los experimentos en los que se realizó la transferencia adoptiva de células DO11.10 transgénico T, se inyectó cada macho Balb / c o ratón hembra (Vena de la cola) con 2,5 millones de células derivadas de los ganglios linfáticos y el bazo de ratones transgénicos DO11.10 del sexo correspondiente Después de la lisis de glóbulos rojos y de lavado. En la primera serie de experimentos, se utilizaron ratones machos. Una hora después de la administración i. v. inyección de células DO11.10, los ratones fueron inyectados s. c. en la línea media dorsal justo sobre la base de la cola con liposomas (0,5 mg de lípido total) que contenía 60:40 PC para liposomas de colesterol o 30:30:40 PS cerebro con un ordenador para el colesterol. Una hora más tarde, los ratones fueron inyectados s. c. en el mismo lugar con OVA de pollo (2 mg) solo, o en presencia de IFA, o con 100 g de LPS. Cuatro y 7 días más tarde, los ganglios linfáticos drenantes se recogieron para el recuento y se analizaron para la expresión de TCR por citometría de flujo, así como la secreción de IL-2 mediante ELISA (ELISA Tech). En una segunda serie de experimentos, se examinó la estereo-especificidad de la respuesta a PS. Veinticuatro horas después de la i. v. inyección de células T CD4 DO11.10, los ratones fueron inyectados s. c. sobre la base de la cola con liposomas (0,5 mg de lípido total) que contenía l POP - - S o POP - d - S como se describió anteriormente, o 200 g de mAb purificado 217G8E9 o su control de isotipo. Una hora más tarde, los ratones fueron inyectados s. c. en el mismo lugar con OVA de pollo (2 mg) en CFA. Siete días más tarde, los ganglios linfáticos drenantes se recogieron para el recuento, el análisis de la expresión de TCR por citometría de flujo, y la medición de las citoquinas (IL-2, IFN-, IL-10, IL-4, y TGF) por ELISA, usando kits adquirido de ELISA Tech. límite inferior de detección para la IL-2 fue de 7,8 pg / ml, por IFN fue de 15,6 pg / ml, para IL-10 fue de 15,6 pg / ml, para la IL-4 fue de 7,8 pg / ml, y para TGF era 15,6 pg / ml. Los ratones de control incluyen los inyectados con células DO11.10 sólo en ausencia de estimulación antigénica, y los ratones no tratados. Para el experimento (ver Fig. 8), 100 g de anticuerpo monoclonal de ratón anti-TGF-o su control de isotipo (IgG1) se inyectó simultáneamente con los liposomas y de nuevo en el momento de la administración de OVA / CFA. Se analizaron los datos de cada ratón individual. Se combinaron los ganglios linfáticos de ambos lados de cada ratón. Número total de leucocitos se obtiene por hemacitómetro. El número total de células T DO11.10 transgénico se determinó por citometría de flujo. células de los nódulos linfáticos se tiñeron con estreptavidina conjugada con 488 conjugado con PE anti-CD4 y KJ1-26 biotinilado (anti-receptor DO11.10), seguido de Alexa. El análisis de dos colores se realizó utilizando el software CellQuest y FACScan. El número total de células DO11.10 se determinó multiplicando las células T CD4 porcentaje DO11.10-positivas por el número total de leucocitos por ratón. Para el experimento se muestra en la Fig. 8. las células de nódulos linfáticos también se tiñeron con PE anti-CD4 y FITC anti-CD19 para identificar linfocitos B (CD4. CD19), PE anti-CD4 y FITC anti-CD138 (syndecan-1) para identificar células plasmáticas (CD4. CD138) o Alexa F4 488 conjugado / 80, y conjugado con PE anti-CD11c para identificar los macrófagos y las células dendríticas. En un tercer conjunto de experimentos, ratones macho BALB / c fueron inyectados con liposomas tal como se describe. A continuación, 30 min más tarde, se les inyectó s. c. con una emulsión que contiene 75 l de IFA (Sigma-Aldrich) y, o bien PBS, 25 g de CFSE en DMSO (CDFA Molecular Probes) o 25 g de CFSE y 300 g de OVA-647 (Molecular Probes). Veinticuatro horas más tarde, los ganglios linfáticos inguinales fueron cosechadas y suspensiones de células individuales hechas. Después del lavado, las células se contaron usando el contador Coulter, y se determinaron los números de células totales de cada ratón. Cada muestra se analizó por citometría de flujo para CFSE (FL1) y las células OVA-647 (FL4) que eran CD11c alta. Los números absolutos de células CFSE / OVA-647 se determinaron utilizando los números de células totales calculados previamente. Para examinar la producción de citoquinas, las células 10 5 DO11.10 T se sembraron en placas de 48 pocillos por cuadruplicado en 0,25 ml de X-Vivo 10 medio (un medio libre de suero patentado de Cambrex Bioscience Walkersville) en presencia o ausencia de OVA ( 100 g / ml). Luego, 24 horas más tarde, los sobrenadantes de pocillos replicados se agruparon, se centrifugaron para eliminar los restos de partículas, y se congelaron a 70 ° C hasta que se analizaron por ELISA. cultivos de células dendríticas de células dendríticas murinas se cultivaron de la médula ósea utilizando métodos descritos previamente con ligeras modificaciones (45). En pocas palabras, fémures, tibias y los huesos pélvicos fueron removidos de 8 a 12 semanas de edad macho BALB / c o ratones C57BL / 6. La médula ósea se lavó abundantemente con HBSS usando una jeringa con una aguja de calibre 25. Las células extraídas Luego se extrajeron dos veces en una jeringa con una aguja de calibre 18 para dispersar las células de los racimos. Esta suspensión de células se pasó a través de un colador de 40-m de células de poros (BD Falcon) para eliminar los restos de tejido. Después las células se colocaron en placas en RPMI 1640 que contiene 10 FCS (Atlanta Biologicals), 1 penicilina / estreptomicina / l - glutamine, 50 M 2-ME, y la cantidad apropiada de GM-CSF murino tal como se determina por experimentos de titulación (GM-CSF murino presente en el sobrenadante del cultivo de la línea celular J558L transfectadas con el gen que codifica el GM-CSF murino proporcionado amablemente por el Dr. I. Mellma, Universidad de Yale, New Haven, CT). células de hibridoma de células T DO11.10 linfocitos T se cultivaron en RPMI 1640 que contiene 10 FCS (Atlanta Biologicals), 1 penicilina / estreptomicina / l - glutamine, piruvato de sodio 1 mM, bicarbonato de sodio 0,2, 0,1 mM de aminoácidos esenciales y no esenciales, 14,4 M 2-ME y 2,92 mg / ml l - glutamine. Los bazos y los ganglios linfáticos se retiraron de adultos DO11.10 machos transgénicos. Los tejidos se homogeneizaron en RPMI 1640 y pasaron a través de tamices de células 40-M. entonces Estas suspensiones de células se lavaron una vez con RPMI 1640, se resuspendieron en RPMI 1640 con 5 FCS, y se colocan en hielo. las células T CD4 fueron enriquecidos por selección negativa utilizando la separación de esferas magnéticas. La pureza se evaluó por citometría de flujo la población se enriqueció a 97 CD4. células CD3 T (datos no mostrados). Brevemente, se suspendieron 10 8 células en 1 ml de RPMI 1640 con 5 FCS y se incubaron con 5 g por cada 10 6 células de anti-CD16 / CD32 durante 10 min en hielo para bloquear FcR. Abs de orientación otros tipos de células (anti-MHC de clase II, anti-B220, anti-CD8, y F4 / 80 todos IgG de rata) se añadieron a continuación a 5 g por cada 10 6 células por 30 min en hielo. Las células fueron lavadas dos veces con RPMI 1640 y se resuspendieron en PBS con BSA 1 y 5 mM EDTA. microperlas MACS recubiertas con IgG de oveja anti-rata y anti-NK1.1 se utilizaron luego para enriquecer las células T CD4 de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Miltenyi Biotec). La estimulación de las células dendríticas de células dendríticas murinos primarios se cultivaron en 100 mm 2 placas de Petri o placas de seis pocillos como se describió anteriormente. Día 8 células dendríticas murinas se estimularon con dosis variables de los liposomas que contienen PC 60:40 a colesterol o 30:30:40 PS a PC con el colesterol (preparado como se describe anteriormente). La dosis de liposomas que se encuentran para ser más efectivo con un mínimo de efectos no específicos era lípido total de 100 m. Por lo tanto, se utilizó esta concentración en todos los experimentos. estimulación de liposomas se llevó a cabo a 37ºC durante 1 h. A continuación se añadió estímulo proinflamatorias, que incluía LPS (100 ng / ml), medio de monocitos cultivados (preparado como se describe anteriormente añadido en una proporción de 1: 1 de medio de monocitos-cultivadas a medio), o los oligonucleótidos que contienen CpG o GPC (5 g / ml). El control de GpC oligonucleótido no logró estimular la maduración de las células dendríticas derivadas de la médula ósea (datos no mostrados). De flujo de detección de citometría de dendríticas marcadores de superficie celular de detección de marcadores de superficie en el día 7 las células dendríticas humanas se llevó a cabo mediante la suspensión de 5 10 5 células en 200 l de medios de tinción (RPMI 1640 suplementado con FCS 2) en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. A cada pocillo se añadió 2,5 g de uno de los Abs descritos anteriormente contra CD11c, CD14, CD80, CD83, CD86, MHC de clase II receptor, CCR7, o PS durante 30 min en hielo. Para Abs primaria no conjugado (anti-CD14 y anti-PS receptor), las células se lavaron dos veces con HBSS, se resuspendieron en 5 10 5 células en 200 l de medio de tinción por pozo, y Abs secundario conjugado con Cy3 añaden a 1/200 definitiva concentración. Después de una incubación de 30 min en hielo, las células se lavaron dos veces con HBSS, se resuspendieron en medio de flujo (PBS suplementado con 2 FCS), y se transfiere a fluir tubos. Citometría de flujo se realizaron en un FACScan o FACSCaliber citómetro y los datos se analizaron con el software ya sea PCLysys o software CellQuest (BD Biosciences). Para la detección de marcadores de superficie celular en las células dendríticas derivadas de médula ósea de ratón, las condiciones de tinción eran idénticos a los descritos anteriormente para los experimentos de células dendríticas humanas, con la excepción de que dos colores citometría de flujo se llevó a cabo. Por lo tanto, FITC anti-CD11c Ab se añadieron (utilizado para distinguir las células dendríticas inmaduras a partir de células precursoras indiferenciadas) de forma simultánea, ya sea con Abs conjugado con PE (anti-CD40, anti-CD80, anti-CD86, o anti-MHC de clase II) o no conjugado primaria Abs (anti-CD14 o anti-receptor de PS, mAb 217G8E9) seguido de Abs secundario conjugado con Cy3. Se llevó a cabo la detección de la fluorescencia y el análisis de dos colores como se describe para las células dendríticas humanas. ensayos de presentación Ag en la presentación in vitro de cualquiera de las proteínas OVA o OVA 323339 péptido se llevó a cabo como sigue: las células murinas derivadas de médula ósea inmaduras dendríticas se cultivaron en placas de seis pocillos a una densidad de 3 10 6 células en 4 ml de medio completo / pocillo . En el día 8, algunas de las células dendríticas inmaduras se estimularon con 100 M liposomas que contienen o bien PC con el colesterol o PC para PS al colesterol (preparado como se ha descrito) durante 30 min a 37ºC. Las células dendríticas se pulsaron entonces con cualquiera de las proteínas o OVA OVA 323339 péptido durante 3 h a 37ºC, lo que permitió tiempo suficiente para ingerir la proteína o péptido soluble. a continuación, se añadió LPS a algunos de los pocillos a una concentración final de 100 ng / ml y las células se deja madurar durante una noche (1,824 h). Después de la incubación durante la noche, las células dendríticas se lavaron dos veces con HBSS y se fijaron en paraformaldehído 0,75 durante 30 min en hielo. Después, las células dendríticas fijadas se lavaron dos veces con HBSS y se resuspendieron en RPMI 1640 con 5 FCS. Cualquiera de las células de hibridoma T DO11.10 o células CD4 T aisladas del bazo y los ganglios linfáticos de ratones transgénicos como se describe DO11.10 se lavaron dos veces con HBSS y se resuspendieron en RPMI 1640 con 5 FCS. células T (5 10 5) y células dendríticas fijos (5 10 4) se combinaron en 200 l por pocillo de una placa de 96 pocillos y se incubaron a 37ºC durante 24 h. Después las células se sedimentaron por centrifugación y los sobrenadantes recogidos. Los sobrenadantes se analizaron para la presencia de IL-2 por ELISA como se describió previamente. Determinación de TNF de la secreción por las células dendríticas para la determinación de TNF, las células dendríticas murinas se cultivaron en placas de seis pocillos como se describió anteriormente. En el día 8, las células se estimularon con PC o PS liposomas seguido de LPS como se ha descrito anteriormente. Después de 48 h, se recogieron los sobrenadantes, se centrifugaron a 14.000 rpm para eliminar las células y restos, y se almacenaron a 20ºC. El TNF-ELISA ratón se adquirió de ELISA Tech el límite inferior de detección fue de 7,8 pg / ml. Análisis estadístico El análisis univariante se realizó en conjuntos de datos para cada experimento para probar la normalidad. modelado lineal general con el contraste entre dos tratamientos se utilizó para comparar medios para datos distribuidos normalmente. Se utilizó la prueba de Wilcoxon para dos muestras para comparar las medias de los datos no distribuidos normalmente. El análisis se realizó con el software SAS (SAS Institute). Para los experimentos de transferencia adoptiva y en experimentos in vitro con células dendríticas, los datos fueron analizados por ANOVA y prueba de Tukey-Kramer, utilizando el software JMP (SAS Institute). Resultados La inyección de liposomas PS reduce inflamación de ganglios linfáticos en respuesta a la inmunización ampliación de los tejidos linfoides secundarios después de los resultados de inmunización de afluencia de la linfa, así como el reclutamiento y la proliferación de las células que responden a los inmunógenos (46). Por lo tanto, se utiliza la medición de la masa del bazo y nódulos linfáticos de drenaje en los ratones que respondieron a la inmunización como un ensayo inicial, simple para la respuesta inmune. ratones BALB / c fueron inmunizados con OVA emulsionado en CFA (OVA / CFA) y ratones C57BL / 6 con el péptido sintético inmunogénico, 2W (AWGALANWAVDS, reconocido en el contexto de IA b) emulsionado en CFA (2W / CFA) (47. 48. 49). La inmunización de ratones BALB / c con OVA / CFA dio lugar a un gran aumento en tanto el bazo y el drenaje de la masa de los ganglios linfáticos (Fig. 1). Los ratones en los que los liposomas que contienen PS-se inyectaron primero en el mismo sitio tenía una reducción mínima en los medios de bazo sin embargo, mostraron los ganglios linfáticos reducido significativamente la masa en comparación con los ratones inyectados con PBS o liposomas de control que contienen PC. Se encontraron resultados similares en ratones C57BL / 6 inyectados con liposomas que contienen PS-seguido de 2 W / CFA inmunización (datos no mostrados). Inyección con liposomas PS reduce el aumento de la masa de tejido del bazo y de los ganglios linfáticos en respuesta a la inmunización. los ratones BALB / Cann se inyectaron por vía subcutánea ya sea con PBS (control positivo), 0,5 mg de PC a los liposomas de colesterol (relación molar 60:40), o 0,5 mg de PS a PC con el colesterol (30:30:40) liposomas. Después de 1 h, los ratones se inmunizaron en la misma zona con OVA / CFA. Después de 7 días, el bazo y los ganglios linfáticos de drenaje se diseccionaron cuidadosamente para eliminar toda la grasa adjunta y la masa de tejido medido. Los resultados indican que en ratones que recibieron inyecciones de liposomas de PS, se muestra una ligera pero no significativa (p 0,05). La inyección de la l pero no estereoisómero D de PS reducen la acumulación de leucocitos, incluyendo células T específicas de Ag-en los ganglios linfáticos en respuesta a la inmunización Nuestros resultados sugieren que los liposomas que contienen PS-inyectaron s. c. en el tejido antes de la inyección de Ag suprime el reclutamiento y proliferación de células en el ganglio linfático de drenaje. Para investigar más la especificidad de esta represión, DO11.10 ingenuo (OVA-específico) de las células T CD4 de los bazos y los ganglios linfáticos de ratones transgénicos se transfirieron por vía i. v. inyección en receptores BALB / c. El uso de la transferencia adoptiva de linfocitos nos permitió identificar las células T CD4 Ag-específicas mediante el Ab (KJ1-26) contra la DO11.10 TCR (47. 48). Los ratones receptores fueron inyectados s. c. sobre la base de la cola con liposomas que contienen ya sea POP - l - S o POP - d - S, seguido de OVA / CFA como se ha descrito. Siete días más tarde, los ganglios linfáticos drenantes se recogieron y el número de leucocitos totales y células DO11.10 T CD4-OVA específicos determinados. Higo. 2 A muestra que la inyección con los liposomas que contienen el estereoisómero L, pero no la d estereoisómero, de PS redujo significativamente el número de leucocitos totales, así como el número de células T CD4 específicos de OVA. El efecto de la l estereoisómero de PS era evidente incluso cuando se usa a 2 lípido total (indicado como baja concentración). El uso de un número limitado de los ratones, también se evaluó los efectos de la PS que contiene liposomas de los efectos adyuvantes de IFA o LPS en la respuesta a OVA por las células DO11.10 adoptivamente transferidas en ratones BALB / c. Los ganglios linfáticos se cosecharon a los 3 días y 7 días después de la inyección. efectos represivos similares en porcentaje de células T CD4 DO11.10 se observaron (Fig. 2 B). Inyección con l estereoisómero pero no estereoisómero D de PS reduce la acumulación de leucocitos y las células T CD4 Ag-específico en respuesta a la inmunización, y el receptor de anti-PS Ab imita este efecto. ratones BALB / c se inyectaron i. v. con células DO11.10 T derivadas del bazo y los ganglios linfáticos de ratones transgénicos. Después de 24 h, los ratones fueron inyectados s. c. sobre la base de la cola con liposomas (0,5 mg de lípido total véase Materiales y Métodos para la composición exacta) que contiene ya sea 30 o 2 POP - l - S o POP - d - S, seguida por s. c. inyección de OVA / CFA. Siete días más tarde, los ganglios linfáticos se recogieron y se determinaron los leucocitos totales (A). El porcentaje de células CD4 T DO11.10 se determinó por citometría de flujo, y se determinó el número total de estas células T multiplicando el porcentaje en número total de leucocitos (B) n 20 ratones por grupo. Una diferencia estadísticamente significativa () de OVA / CFA solo (p 0,05) se indica. El estéreo-especificidad de la respuesta a PS sugirió la implicación de un receptor específico para PS. Una de estas receptor fue descrito recientemente (50). Un específico Ab para esta proteína se ha demostrado que imitar los efectos de las células apoptóticas y de liposomas que contienen PS. Por lo tanto, se inyectaron 200 g de Ab de control altamente purificada o su isotipo s. c. sobre la base de la cola, seguido de OVA / CFA, como se describe. Ganglios linfáticos de drenaje cosecharon 7 días más tarde mostraron disminución del número de leucocitos totales, así como un número reducido de células T CD4 DO11.10, lo que sugiere que el receptor FS estaba mediando las respuestas estereoespecíficos a PS (datos no mostrados). La inyección de liposomas PS o anti-PS receptor de Ab producción inhibida de citocinas efectoras de células T DO11.10 después de la transferencia adoptiva A continuación se determinó la respuesta de citoquinas de células de nódulos linfáticos de los experimentos de transferencia adoptiva. El número de células añadidas a los pocillos se ajustó de modo que el número de células DO11.10 por pocillo fue equivalente entre los diversos grupos de tratamiento. Las células se incubaron en medio libre de suero durante 24 h en presencia (denominada Ag reestimulación en la Fig. 3) o ausencia (espontánea) de OVA. Se recogieron los sobrenadantes y se analizaron para IL-2, IFN, IL-4, IL-10, y la producción de TGF-por ELISA. Como se muestra en la Fig. 3. A y B . niveles espontáneos de IL-2 e IFN-se redujeron en las células de los ratones pretratados con POP - l - S, pero no emergente d - S. Además, los niveles de estas citoquinas se mantuvieron significativamente inferior en células de nódulos linfáticos de ratones tratados con - S POP - l, incluso si las células se volvieron a estimular con Ag. La represión de estas dos citoquinas efectoras no parece estar mediado por cualquiera de IL-4 o IL-10. En el caso de los primeros, los bajos niveles fueron producidos por las células de ratones inmunizados con OVA / CFA, pero los niveles se redujeron significativamente por l - S POP - (Fig. 3 C). 2. 1. Como se muestra en la Fig. 5. B. 7. 2. 8. Como se muestra en la Fig. 8.